基因操作工具-腺病毒
3. 制备转染试剂和质粒的复合物：
关键步骤：推荐使用Qiagen质粒大抽试剂盒或相当的试剂盒所制备的质粒。
取1.5 ml Ep管一支，加入待转染的病毒载体质粒，用Opti-MEM培养基补齐到500 μl，轻轻混匀；
取1.5 ml Ep管一支，加入35 μl Trans-EZ溶液，用Opti-MEM培养基补齐到500 μl，轻轻混匀；
将Trans-EZ稀释液滴加到质粒稀释液中，边加边轻轻混匀后在室温放置20分钟，使DNA和Trans-EZ充分结合形成稳定的转染复合体。
4. 取出细胞培养板，将上面得到的DNA-Trans-EZ复合体加入到细胞培养器皿中，做好标记，放回培养箱；
5. 6h后吸去培养基，PBS洗一次，加入10mL新鲜生长培养基培养，如有大量细胞漂起，则不去上清，加入6mL完全培养基，37℃过夜培养，次日换液；
6. 三天换一次，大概7-15天左右出现病毒空斑，等待病变后纯化。
7. 关于SunBio Trans-EZ 病毒载体制备转染试剂及转染信息，请登陆网站：http://www.sbo-bio.com.cn/
腺病毒的纯化
经典氯化铯梯度离心法：
注释：许多实验研究都是用原病毒感染细胞，然而有些实验尤其是动物实验，通常使用纯化的病毒。本公司采用Hitt等人（1998）的经典氯化铯梯度离心方法。（以30×150mm培养皿中富集病毒的方法为例）。
1. 准备细胞：对于30×150mm培养皿：当所有被感染的细胞变圆并且部分漂浮，刮净培养皿，然后将细胞和上清转入50ml离心管中，750g，离心10分钟。用15ml的0.1M的Tris-HCl(PH 8.0)重悬。-80度保存。
2. 溶解样品，每15ml细胞溶解物加入1.5ml 5%脱氧胆酸钠，混匀室温孵育30分钟。这个结果是相对澄清的，高粘度的悬浮液。
3. 每15ml的细胞溶解物加入150ul 氯化镁和75ul的DNase Ⅰ溶液，混匀，37度孵育30-60分钟，每隔10分钟混匀一次。粘稠度应该减小，仅仅比水的稍微粘稠些。
5. 同时，准备氯化铯梯度（用SW41转子的超纯管子，用于5ml的样品）：每个管子中加0.5ml的1.5g/cc的氯化铯溶液，轻轻的在上面铺上3ml的1.35 g/cc的氯化铯溶液，轻轻的再铺上一层3ml的1.25 g/cc的氯化铯溶液。加好之后不可以打乱梯度。
6. 每个梯度的管子加入第4步中得到的上清5ml。
7. 用SW41转子，4度，35000rpm离心，1小时（加速和减速设置1）。
8. 收集病毒条带（应该在1.25 g/cc和1.35 g/cc之间）。
9. 将得到的病毒条带转移到SW50.1转子配套的无菌管子中，用1.35 g/cc溶液加满管子），混匀。用SW50.1转子，4度，35000rpm，离心16-20小时。（或者用SW41转子，10度，35000rpm，离心16-24小时）
10. 用尽可能小的体积收集病毒（通常是0.5-1ml），转入透析袋中，4度，500倍体积（或者更大）的10Mm Tris-HCl，PH 8.0透析，至少24小时，之间更换二-三次溶液。
11. 透析之后，纯化的病毒分装小份-80保存。
其他腺病毒纯化方法：
1、Shabram等设计的大规模腺病毒纯化优化方案为：
粗提液先通过DEAE阴离子交换柱，再通过固定化锌吸附色谱(IZAC)柱。
2、切向流超滤法：
切向流过滤（Tangential Flow Filtration ，简称TFF ）是制药工艺中已经被广泛采用的一种过滤操作方式，它的应用包括澄清过滤、产物浓缩、除热原、除小分子杂质、脱盐和缓冲液置换、病毒型疫苗纯化等。使用最新的切向流超滤设备纯化腺病毒，具有以下优点：
①切向流方式，应用超滤膜包，分离效率高，处理速度快；
②易于线性放大，最大限度减少从小规模制备到大规模生产的时间和费用；
③无需再用昂贵的不锈钢超滤架；
④一体化设计，操作简便，相比较传统纯化方式，省时省力，长远看也节省成本；
(注：上述两类纯化方法，因存在大损耗和最小处理量要求，均不适合小规模实验室使用)
病毒滴度的测定
传统测定方法：
1、VP测定法（病毒颗粒）或OPV（光学颗粒单位）
测定VP的方法是测定病毒颗粒在260nm处的吸光度（病毒DNA和蛋白的总吸光度中主要为DNA），1个OD值相当于1.1×1012个病毒颗粒。这种方法只能提供病毒的量，至于质，比如是否含有缺陷性颗粒则没有考虑在内。
2、GTU测定法（基因转移单位）
GTU测定感染后能表达报告基因的细胞数量。这个过程中，病毒将DNA转入细胞，在一个感染周期结束前立即测定表达报告基因的细胞。如果重组腺病毒含有报告基因如GFP或LacZ等则可以用这种方法进行测定。
3、PFU测定法（空斑形成单位）
PFU是测定腺病毒滴度最早的标准方法，主要测定单层细胞培养中病毒空斑的形成。空斑形成需要许多个感染周期，得到最终结果通常需要三个星期。一般来说，这种方法得到的结果很少能在其它实验室重复。
TCID50测定法（50%组织培养感染剂量）
TCID50已被用于测定许多种病毒的滴度，病毒稀释液与细胞在96孔板进行培养，然后监测每孔是否CPE。TCID50方法相对PFU方法而言有几个优点，如速度快，结果更具预料性，在不同操作个体间也更稳定。
TCID50法操作步骤：
1. 在实验前24小时，向96孔板每孔加入100μl HEK293细胞悬液，约1x103个细胞；
2. 准备10个无菌的Ep管，在第一个Ep管中加入990 μl的完全培养液，其余的9个管子中各加入900 μl的完全培养液；
3. 待测病毒液的稀释：取10μl腺病毒原液加入990 μl 的Ep管中做1:100稀释（10-2）；然后以此为起点，再取100μl稀释液加入到900 μl 的Ep管中做1:10稀释(10-3)，直至稀释到10-14；
4. 从孵箱中取出96孔板，在显微镜下确定每孔的细胞均生长良好。吸弃旧培养液，然后依次将10-7至10-14稀释的病毒液加入96孔板中，每一稀释度占用一行，每一行10孔重复，每孔加入90 μl病毒稀释液，而每一行的第11-12孔均加入90 μl不含病毒的完全培养基作为对照；
5. 将96孔板置于置37 ℃，5％ CO2细胞培养箱中继续培养。
6. 10d后观察细胞病变现象，并对CPE孔进行计数，计算每一行的阳性率，计算病毒滴度(Spearman-Karber Method):
病毒滴度=10(x+0.8) (pfu/ml)
x=10-1到10-12依次稀释度下CPE阳性率总和
公式使用条件：
阴性对照没有CPE和生长抑制现象；加入最小稀释浓度病毒液的孔均有CPE
举例说明：
病毒滴度=10(9+0.4+0.2+0.8)
=1010.4(pfu/ml)
=2.5×1010(pfu/ml)
编辑: cq
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