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DNA聚合酶

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发布日期：2011-11-28 17:47 文章来源：杭州朗基
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关键词： 丁香园 生物专题 杭州朗基 DNA聚合酶 　 点击次数：

摘自：Alkami Quick Guide for PCR

DNA聚合酶：

每种热稳定的聚合酶都有唯一的特性，例如pH值和盐浓度都会影响到PCR的效率。高保真性的DNA聚合酶一般都具有3'-5'外切核酸酶活性，这种较读活性能使聚合酶校正DNA链合成中错误掺入的核苷酸。多种优化的聚合酶混合物整合一种标准的聚合酶，例如Taq和少量的高保真的聚合酶，例如Pfu、Vent和Deep Vent等。

PCR过程中的一个显著的问题是在各种各样的条件下使用不同的聚合酶时，缺乏可信性。聚合酶的错误可在延伸阶段的5个不同的行动中发生：聚合酶同dNTP结合；磷酸二酯键形成的速率；焦磷酸释放速率；碱基错误掺入后的继续延伸；3'-5'外切酶的较读活性。

除DNA聚合酶外，还有几个原因也会引起错误率的变化，一个潜在的原因是DNA的物理损坏引起碱基错误掺入、缺口和交叉产物。模板状况也会影响可信性，但这些情况在确定和比较错误率时一般不予以比较。

各类聚合酶的错误率定义为每个核苷酸的错误率。几项研究表明每延伸一个碱基，聚合酶的错误率在2.1×10-4～1.6×10-6之间。

另外，PCR过程中能发生的错误类型依赖于特定的DNA聚合酶。例如高保真聚合酶在PCR实验中倾向从引物的3'端以每次切下一个碱基的方式降解单链DNA引物，结果引物在与模板退火前，一些引物的结合位点已经因为本身降解而发生改为。需要注意的是，长的引物比起短的引物，初始的降解率更高。

下面介绍一些常见的聚合酶

Taq (Thermus aquaticus)

Taq酶不具备3'-5'外切酶较读功能，因而有相对较高的错误率。不过，通过修改反应条件，Taq的错误率可降低2.8倍（从2×10-4到7.2×10-5）(Ling et. al. 1991)。

观察到的Taq酶引起的最常见的突变是AT向GC的转换(Keohavong and Thilly 1989)。如果模板DNA能形成二级结构，Taq酶很可能产生删除突变(Cariello et al. 1991)。

有关Taq酶的注意事项：
      1. Taq稀释后不能长期保存；
      2. 将Taq酶保存在其相应的缓冲液中；
      3. Taq酶在室温下有活性；
      4. Taq酶一段时间内忘记放入冰箱而放在室温下，不影响活性；
      5. dNTP可能比Taq酶更易降解；
      6. 尽可能将Taq酶一直放在冰上，特别是当Taq和其它成分混在一起时；
      7. Taq酶可在室温下延长引物；

建议使用的PCR试剂和已知的特性：
      dNTPs:   40µM - 200µM
      Mg2+:  1 mM - 10 mM
      盐:  50 mM KCl
      pH:  8.0 - 8.8
      缓冲液:  10 mM Tris-HCl, pH 8.3
      添加剂:   BSA, NP-40, Tween 20
      错误率:
      2.4 x 10-5 平移突变/bp (Tindall and Kunkel, 1988)
      1.1 x 10-4 /bp (Tindall and Kunkel, 1988)
      2.1 x 10-4 /bp (Keohavang and Thilly, 1989)
      7.2 x 10-5 /bp (Ling et al., 1991)
      8.9 x 10-5 /bp (Cariello et al., 1991)
      2.0 x 10-5 /bp (Lundberg et al., 1991)
      1.1 x 10-4 /bp (Barnes, 1992)
      2.0 x 10-4 /bp
      效率/循环:   36% - 88%

KlenTaq (Thermus aquaticus, N端删除突变)

KlenTaq是一种无5'外切酶活性、N端删除突变的Taq DNA聚合酶。其最适Mg离子浓度范围比大部分聚合酶都广，所有容易优化反应条件。

建议使用的PCR试剂和已知的特性：
      错误率:
      5.1 x 10-5 /bp (Barnes, 1992)

Stoffel Fragment(Taq DNA聚合酶羧基端的544个氨基酸)

建议使用的PCR试剂和已知的特性：

dNTPs:   40 - 200µM each
      Mg2+ :  2 - 10 mM
      盐:  10 mM KCl
      pH:  7.0 - 7.5
      缓冲液:  10 mM Tris-HCl, pH 8.3
      添加剂:   BSA, Tween 20

Tth (Thermus thermophilus)

Tth聚合酶在存在Mn离子的条件下，可有效的逆转录RNA（达到1000bp长），在Mg存在下以DNA为模板合成DNA。另外，因为Tth在高温下仍有RT活性，因此可克服RNA高程度的二级结构带来的问题。

建议使用的PCR试剂和已知的特性：
      Mg2+:  1.5 mM
      盐:  90 mM KCl
      pH:  9 at 25 ° C
      缓冲液:  10 mM Tris-HCl, pH 8.3
      添加剂:   glycerol, Tween 20（有助于Mn离子的活性）
      延伸:  75° C

Pfu (Pyrococcus furiosus)

Pfu是一种高保真的DNA聚合酶，热稳定性很高，错误率很低。PCR反应使用Pfu聚合酶产生的是平末端的PCR产物。Pfu需要的延伸时间是1.5-2分钟/kb长的扩增产物。

建议使用的PCR试剂和已知的特性：
      dNTPs:   100 µM - 250 µM
      Mg2+:  1.5 mM
      盐:  10 mM KCl, 6 mM (NH4)2SO4
pH:  8.2 - 8.4
      缓冲液:   20 mM Tris-HCl, pH 8.2 or 10 mM Tris-HCl, pH 8.8
      添加剂:   BSA, Triton X-100

错误率:
      1.6 x 10-6 /base (Lundberg et al., 1991)
      7 x 10 -7 /base (P. Andre - unpublished)
      1.3 X 10-6 /base (Cline et al., 1996)

效率/循环:   60%

编辑: cq

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