基因操作工具-腺病毒
重组腺病毒简介、安全操作规范和载体选择
重组腺病毒简介
腺病毒（Adenovirus，AdV）是一种非整合型双链DNA病毒，在自然界中广泛分布。尽管一些类型的腺病毒会引起人胃肠道、呼吸系统或眼部的急性感染，但是应用于基因治疗研究的腺病毒是安全的，对人无致病、致畸、致癌的潜在危害。腺病毒颗粒没有包膜的直径为70～90nm的颗粒，由252个壳粒呈二十面体排列构成。每个壳粒的直径为7～9nm。衣壳里是线状双链DNA分子，约含35 000 bp，两端各有长约100 bp的反向重复序列。据Journal of Gene Medicine的统计，截至2006年，在全球1192项基因治疗临床试验方案中，有305项(26％)使用腺病毒载体，首次超过反转录病毒，居第一位。由于腺病毒可以感染呼吸道和消化道，所以它所介导的基因治疗不仅可以静脉注射，还可以通过口服经肠道吸收或通过喷雾、滴注经呼吸道吸收，使得基因治疗易于推广应用。腺病毒易于制备、纯化和浓缩，病毒滴度可以高达1011pfu/ml，比反转录病毒高出10000倍以上。所以，它介导的基因治疗常采用in vivo的方式进行，是目前基因治疗临床试验中应用最多的一种载体。
腺病毒构造 腺病毒基因治疗
（注：上述图片来自互动百科）
目前根据需要已经开发三代腺病毒载体：E1区或者E1&E3缺失的载体被称作第一代腺病毒载体；E2区或者E2&E4缺失的载体被称作第二代腺病毒载体；依赖于辅助病毒的腺病毒载体（Helper-Dependent Ad，HD-Ad）通常也称作无偿腺病毒或者高容量载体被划分为第三代腺病毒载体。
经典的双质粒共转染法（同源重组）
原理是同源重组。在腺病毒左臂区域（通常缺失E1基因区）插入目的基因表达盒构成腺病毒穿梭质粒，与带有腺病毒全基因组（通常缺失E1基因区）的大质粒共同转染携带E1基因区的细胞如293细胞，两种质粒在293细胞内通过同源重组形成重组腺病毒基因组，并包装成病毒颗粒。主要缺点是重组效率比较低。
AdEasyTM包装系统
AdEasyTM包装系统主要的特点是利用Cre/loxP系统在大肠杆菌中完成外源基因插入腺病毒基因组的过程，获得环状的重组腺病毒基因组，并且具有在细菌中复制的必需元件。将重组腺病毒基因组酶切线性化后转染293细胞，避免了双质粒共转染得到重组腺病毒。由于获得重组腺病毒质粒有明显的筛选方法，操作步骤也比较好掌握，因此这个系统一出现就受到极大的欢迎。
使用这个系统需要注意以下问题：
1） 要用能表达RecA重组酶的特定的大肠杆菌，建议建立菌种库以免细菌发生变化；
2） 由于重组是在细菌中发生的，微小的基因组变化不易发现；
3） 要获得高品质的重组腺病毒毒种（高病毒产量、高目的基因表达）应挑选多个重组腺病毒质粒，分别转染293细胞，获得多个重组病毒来筛选。
AdMax包装系统
AdMax包装系统是通过Cre/loxP获得重组病毒，这个过程发生在293细胞中，从而避免在细菌中重组。将克隆了外源基因的腺病毒穿梭质粒与携带了腺病毒大部分基因组的包装质粒共转染293细胞，利用Cre/loxP系统的作用实现重组，产生重组腺病毒。这个系统有多种优势，包括操作简便、重组效率高、获得的病毒产率高（一般大于104vp/cell）、目的基因的表达水平高（因为mCMV启动子比hCMV启动子强若干倍）等。
与目前使用最普及的AdEasy系统相比，有一定的优势：AdMax系统只需要2~4周就能完成从质粒构建到重组出毒，成功率大于98%（其中95%的克隆含有目的基因），因在真核细胞内重组出毒，保持了对腺病毒的生存压力，有助于重组腺病毒的基因组的完整性；而AdEasy系统的出毒成功率只有18-34%（Stratagene公司新版的AdEasy XL系统成功率在94%左右），且在原核细胞（BJ5183）中完成病毒基因组重组，理论上，失去了生存压力的腺病毒基因组更容易发生突变，病毒遗传背景及活性可能会受到影响。
关于AdMax腺病毒包装系统的详情，请登陆网站：http://www.microbix.com/
AdmaxTM 重组腺病
腺病毒载体有下列优点：
（1）腺病毒的基因结构与功能研究的比较清楚；
（2）可装入基因的容量较大；
（3）转染范围广，转染率较高，所有腺病毒载体均有转染分裂期和非分裂期细胞的能力；
（4）不整合到靶细胞基因组，无插入突变，无致癌性，对人无致病、致畸、致癌的潜在危害；
（5）可以复制出滴度高（可以达到1011VP/ml）、稳定性好、基因转移效率高的病毒；
（6）可以在肠道、呼吸道繁殖，具有口服活疫苗的发展前景；
（7）很容易进行临床应用规模的商业化生产，其病毒储藏及运送条件均十分清楚；
腺病毒载体的缺点主要是：
运输的基因不能持续表达，通常只表达5-20天，以及易引起局部组织炎症反应和机体免疫反应，针对这一缺憾，上海生博在Adeasy、AdMax等腺病毒系统的基础上，经过不断的改进与优化，建立了一套成熟的腺病毒包装系统，已解决各类科研用户的不同需求。该系统是以复制缺陷型腺病毒DNA为骨架构建成的重组腺病毒系统，在穿梭载体、病毒骨架载体及包装细胞系等方面有很大优势，出毒快捷、滴度高、包装可靠。
腺病毒包装服务分过表达用腺病毒包装和RNA干扰用腺病毒包装。
编辑: cq
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