细胞培养中霉菌污染问题

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发布日期：2012-02-20 12:56 文章来源：丁香通
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关键词： 丁香园 生物专题 义翘神州 细胞培养 细胞污染 　 点击次数：

neighboour：我养的VM总是出问题，原代培养后1-2天内没有什么问题，换液一次后1天毛病开始出现。

（1）加血清的VM细胞出现丝状漂浮物质，生长快速，培养液不混浊，细胞生长差。贴图1

（2）不加血清培养的VM细胞没有出现这种情况；

（3）两者均出现散在的黑色“细胞形状”的物质，（贴图2）经观察未见明显增长和数量增多。

我师姐说可能是霉菌污染，并告知我严重的后果，我不知道是不是

我的血清有问题？但是我师姐也用同一大瓶分装的血清，她没有这种情况出现。而且上次出现过一次污染之后，我抛弃了我原有的DF12和血清，重新配置和分装（2）是否为我换液过程中操作不慎？我以前在其他试验室也是如此操作，没有出现过问题的呀。（3）黑色的小颗粒物质是否和使用酒精灯过火玻璃吸管有关？我师姐的细胞有时也出现过这种情况。在以前的培养室（用液化气）内没有出现过这种情况。我不敢肯定这次的污染是否和这些物质有关。（4）如果是霉菌污染，该如何消毒呀？？

fancychen_78：你的真的是真菌污染，链状的菌珠是真菌的菌丝，你的培养液中加了双抗吗，一般双抗终浓度为：青霉素100U/ml ,链霉素100u/ml，市售的青霉素为80万U/瓶，溶于4ml体积内，每1000ml培养液中取0.5ml，链霉素为100万u/ml，溶于5ml体积内，每1000ml培养液中取0.5ml。污染严重时可以采用5-10倍的冲击剂量。已经吸取过细胞或培养液的吸管不要放在过分烧，甚至可以不少，否则，蛋白烧后，会释放有毒物质

midas：建议可以先把液体过滤一下，在悬浮细胞，如果还有问题的话，就怀疑是在操作中有问题－－这时最好先看看别人的操作！

neighboour：midas是说我把DF12过滤，还是说把培养皿内的培养液过滤，另外，如果是真菌感染的话，双抗是否没有作用呀。

midas：当然是把加了血清的DF12过滤！

生物迷：介绍点我的经验：真菌大多悬浮于液体表面,如果发现有少量真菌污染可用大量PBS或D-HANKS冲洗,加含有双抗的培养基培养观察3天,然后看有没有真菌.我用这种方法救了一瓶非常宝贵的细胞(用GIBCO胎牛血清外加FGF-2培养了一个月的MSC).

seaman_wang：如果你霉菌污染，有两种方法，一种是你制备一些小鼠的饲养细胞加入板上，一起培养，让饲养细胞中的巨噬细胞吃到霉菌。第二种，在培养基中加入制菌霉素。

PINX：是真菌污染，可以用两性酶素B试试看，不要用国产的，因为试剂不纯，有较大毒性，GIBCO有商品化的两性酶素，我师妹用过效果不错。

heimukai13：请问:我先配置DMEM,然后过滤,吸3ml检菌三天,若无菌,添加FBS和双抗,过滤后贮存备用.(不知这样对否?因为我是从别的实验室学的,我连续几次配,检菌时都发现培养基表面有一层薄薄的如雪花形状的东西,它在配完培养基第二天下午六七点还看不到,而到九十点就能看到好多,非常迅速,但往后几天却又不怎么长了,培养液一直是清澈的,很纳闷,不知是什么东西,)

若配置DMEM后不检菌,而直接加FBS和双抗,成为全培养基,过滤备用,可以吗?

asd1191：双抗要在配DMEM时就要加，然后过滤！过滤后最好在DMEM中加一点血清在培养，这样长菌的话快！过滤前是不加血清的，因为血清是很难过滤的！培养基表面的如雪花形状的东西可能是长菌的，你摇晃一下瓶子，若浑浊了，则很有可能污染了！另外培养基最好不要反复过滤！这样营养成分会丢失的！另外反复过滤的话会偏碱！

heimukai13：哦,原来要先加双抗的!加了双抗,还需要检菌吗,我想一般就生不了细菌了吧!我不加血清都有漂浮物了,会不会是真菌呢,是的话,怎么防止呢?那些雪花状的东东,摇一下,还是在表面荡来荡去,培养液清澈.(见图)我过滤加FBS后的培养液很好过滤的!怎么回事呢?

hualey：加双抗也只是防止一般染菌，但像支原体等污染就很难起作用，所以加了双抗之后还是要验菌的。感觉你那东西像染菌，因为1）你没加双抗；2）开始没有，第二天才出现（除非你的培养基pH发生大的变化，一般不可能）。鉴于你每次都出现这种情况，你是否可考虑环境或操作有问题，你也没说具体，所以只能作为建议。小牛血清不好滤是相对的，我滤过小牛血清，只是比不加血清的培养基难滤，有时含血清培养基用久了，我还用滤器滤过呢！

heimukai13：我第一次配时没有发现这种情况,后面三次操作都一样,而且用的都是刚灭过菌的东西,而出现照片上这种东西了,会不会是培养液里的氨基酸什么的析出来了呢,因为这雪花样东西过上几天还是这么多,是菌的话应该长疯了吧!而如果是支原体的话,应该肉眼看不见的了.

scp：应该不是氨基酸析出，若是氨基酸析出的话沉淀是在底部的。漂浮在上面会不会是霉菌呀？你有没有用这种培养基养过细胞呀？不妨尝试一下看看有没有污染，如果没有污染的话，大可继续使用。还有。双抗一定要在过滤之前就加上，血清最好也是这样（虽然过滤速度会慢一些）。

heimukai13：应该不是霉菌吧,霉菌是丝丝连连的,绒球球样,长起来好多就悬浮在培养液里了,有一瓶细胞曾经污染过,这个就不一样了!我试试看用它来培养细胞!

朱晶：：双抗一定在要滤之前加，对于DMEM培养基我建议在-20冻存后，如果想用最好提前一天化出来，放到4度里放一天再用，这样比较好，因为这种培养基极愿意产生一些析出物，放置一天会就会溶开了。而且我觉得血清最好还是不要过滤，里面含有一些大分子的营养成份，如果过滤的话对血清本身来说是一种损失。

szmengjie：我第一次培养T淋巴细胞，加了PHA刺激其生长。发现显微镜下它们长得特别快，昨天还是密度适中的圆圆，亮亮的小豌豆一样的游离的细胞。细胞中间有些聚集成团的颜色较深的象一堆血小板一样的东西。今天一看，已是长得平铺了一视野的密密麻麻的看不出单个细胞的形态，大小。呈向心性分布，即中间密度尤高，而越到边缘，则稀疏点。在稀疏处可看到圆圆，亮亮的小豌豆一样的游离的细胞。肉眼培养液里有白色絮状物。白色絮状物究竟是污染还是细胞数太多？

菊花与刀：是不是霉菌感染呢，我前段时间培养的细胞最后就是感染霉菌了，就是一团一团的漂在上面，中间密度高，周围稀疏，高倍镜下可以看到菌丝。

szmengjie：我想霉菌污染是有可能，我用的是24孔培养板，因为标本是断断续续地来，一次只能用其中几个，将那些细胞悬液吸走后，因还有没用过的孔，舍不得丢掉培养板。过一天，看那些曾用过的孔，孔底部长出象雪花一样的，也可说象海藻一样，每个枝象细胞生物学上分子筛的图像一样。我想问：1 细胞太多能出现白色沉淀吗？2 霉菌污染除开看到菌丝，还有其他方法证明其存在吗？早期有什么补救措施吗？3我对细胞培养时出现的污染实在没有概念。有没有哪里提供图谱，让我们这些新手认认敌人的面貌呢？

culture-spirit：1、可以，镜下可见此处细胞程大团分布

2、如果霉菌污染已经到了出现白色沉淀的时候，一般能够看到菌丝了，镜下相当明显

3、这个我也没有找到，好象一些细胞培养的书付页里有，可以请教其他战友

qjzhou2000：

1、不会是 沉淀的，仔细看应该还是可以看到细胞形态的，你用的是不是olmpus的相差境？那种倒置境的相差效果很好，细胞看起来有点象珍珠。

2、霉菌看到菌丝的时候就很厉害了，早期不容易发现，可以加两性霉素之类的抗霉菌的抗生素，具体请在该区搜索，很多都讲到了。

3、现在还没找到，不过一些描述还是很直观的。

midas：细胞数太多会出现片状的脱落，所以白色絮状物污染的可能性大些！

独上高楼：霉菌污染后细胞多生长很慢，象你这种情况，细胞一夜就长满，霉菌污染的可能性不大。另外，霉菌污染也不能一下就看出白色絮状物，而是先在镜下看到较稀少的短小黑色分枝串珠，再看到较密集的短小黑色分枝串珠，最后才能肉眼看到白色絮状物，这个过程大约要1个星期左右，而且在这期间细胞几乎不生长。

szmengjie：前段时间我老被这种在细胞培养液中白色的象一片白膜的东西困扰。40倍镜下同“细胞污染讨论区”贴出的图片一样。上周我送了个培养，结果证实是真菌污染。显微镜下（100倍油镜）染色后可见到一颗颗象红色的南瓜子一样的东西（真菌孢子）。据细菌室的老师说还可在这些“红南瓜子”间见到丝一样的东西。可能就是菌丝了。

我已经非常注意实验器材的消毒灭菌，操作应该也没问题。于是将试剂一个一个吸取了放在显微镜下观察，发现是洗细胞的HANK'S液被真菌污染了!现在我已经换了HANK'S液，这种污染可以说被控制了。

yoyo781206：我想应该是污染了，因为我也遇到过，过几天就看到放射状的菌丝了

topgun：象霉菌的菌丝，但应该观察其数量是否增多？因为霉菌污染在2-3天内可见大量的菌丝！如果是不小心带进去的棉絮则不会有数量的增加且培养基也不会变混浊。

yuandong：我想应是霉菌，白色，絮状，培养基变成了黄色。

apple800828：不象霉菌污染。前两天我培养的内皮细胞被霉菌感染了，好典型的树枝分叉样。象抽丝一般。

chenting100：是霉菌，我们的细胞就经常出现这种污染，实验室老师说霉菌有好多种变异呢。

huvec：其中有多细胞真菌污染的特征性标志：菌丝！

wujinghui：我得细胞培养液中不知道是什么东东，它漂浮生长，在瓶底是白色的，在低倍境下就能看到，在培养瓶里边呈葡萄状，还有的呈树枝状，刚开始时候生长的不快，但是很快就长得很快。不知道这个东西是什么东西，英文名字怎么写，最好能告诉以下如何控制！

ya2cyto：霉菌感染。霉菌是以孢子在空气中传播，细胞肯定是不能要的了，一旦污染很难控制

用环氧乙酸熏蒸培养箱，最后再对培养箱进行无菌实验方可使用

wujinghui：不是霉菌，因为霉菌不用显微镜就能看得到的 。我这个不用显微镜是看不到。

shyaroom：不信？你再放个三天，肯定就能用肉眼看到啦，呵呵。不过建议你换个地方放，别把其它细胞再给污染了。

ylh1976：霉菌，树枝状的东西是菌丝，葡萄状是霉菌。赶紧处理掉细胞，培养箱、操作台还有整个培养室好好消毒一下。梅雨季节要千万小心，空气中到处都有霉菌孢子。

编辑: cq

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