细胞培养中霉菌污染问题

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发布日期：2012-02-20 12:56 文章来源：丁香通
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关键词： 丁香园 生物专题 义翘神州 细胞培养 细胞污染 　 点击次数：

深谷幽兰：各位，有时鸡胚成纤维细胞也连在一起，呈树枝分叉状，而正常的细胞单个散在，这是怎么回事？

junny999：我的一个同事养的细胞被霉菌污染，我与她共用一个培养箱，为防止交叉污染，我想在我的培养基里加点抗霉菌的药，请教加哪一种药物比较好？剂量怎样添加？我养的是MSC

XTYang：Invitrogen公司的Fungizone, 1%(v/v)的用量。对有些细胞有毒害作用。

renjiaqiang：我觉得你最好不要加，我加过抗霉菌药物后细胞生长很慢，而且形状也发生改变，不得已重新买了一株细胞，你现在可以先把细胞冻存，将培养箱消毒后继续进行实验。

lingzhiting：最好不要用吧！我用过nystatin，40Iu/mL。霉菌没长起来，不过也许是不溶的缘故，细胞生长很慢，而且还引入了不明杂质，洗了几次，才逐渐洗去。

wuguojun680510：如果没有长真菌就不要加抗真菌药物，因抗真菌药物有较强的细胞毒性，加了结果会适得其反。最好能把环境处理一下。

qianyimei：星期一复苏了一支细胞株，养到星期三还好好的。心太急。老希望它能长的快些，所以，将一瓶配成三瓶用，结果倒好，今天早上一来，就发现里面长了很多成团的碎片状的东西，众师兄都说是霉菌，叫我倒掉，好可惜，好郁闷！早知道就不换液了，这一换，全军覆没。那位能有更好的办法吗。

zhaoqingshan：用含双抗的PBS洗几遍，换上好的培养液（比如用点好的胎牛血清）；每天洗1-2次，只要细胞状态还好，洗几天，就能把霉菌去除。然后，检查霉菌污染的原因，清除污染源。zjuaxiu：根据经验霉菌污染了用双抗的pbs冲洗基本是没什么作用，只能是浪费双抗pbs时间

zhaoqingshan：那只是说明你的经验，不巧的很，我的细胞(细胞很娇贵，培养液价值约10元/ml)去年七月霉菌污染了一次，全部抢救过来。不可否认很多时候是抢救不回来，前提条件是早发现污染，霉菌对细胞还没有构成太大伤害时候，是可能抢救回来的。当然，最重要的是不要有污染了，预防最重要，即无菌观念要强。

flyingpumc：用3微克每毫升的两性霉素杀杀试试!!!

eweiren：如果不是唯一的一管细胞，我觉得没有必要费这么大力气去挽救，因为有了霉菌，基本上是无法去除的，通过换液只能达到抑制真菌的生长，在镜下看不到不代表不存在，只是由于少或者芽孢看不到，一段时间后它可能还会出来，耽误试验啊！

zhaoqingshan Re:碧海娃娃

双抗PBS是指含有双抗(青链霉素)PBS（磷酸盐缓冲液，也不能杀死霉菌，杀霉菌应该用两性霉素或制霉菌素），使用双抗PBS冲洗仅仅是预防其它细菌的污染而已。

Re:eweiren ，你说的是很对的，真正严格的实验是不应该有污染的。

细胞株拿来后，传代几次，细胞多了，就应该冻存一些，一方面以免细胞传代次数多了变成非二倍体或者其它变异，另外就是以防污染。如果自己培养的原代细胞，可以挽救一下试试，大部分情况是难以回天的，看运气了。

不过，我那次污染正是霉季，一般实验室在这个时候，可能就不养细胞了，我们实验室是我们院里无菌观念最严格的一个实验室，在这以前，细胞从来没有污染过。那时候可能是因为空调很久没有擦洗消毒了，而我又太大意，因此感染霉菌了。不过，那次我还真的就救回来了，因为我的培养液中，营养条件特别好，而且我每天洗几次，换液，细胞没有任何的受影响的表现，我做的是原代细胞传代到第三代，刚好该做实验，因此就全部用来做了同一批的实验。

避免真菌污染的几个措施：

1、严格的无菌操作;

2、无菌间定期打扫、消毒，保持干燥；

3、各种培养液、培养器皿的严格消毒；

4、温箱中消毒水中放置过饱和的消毒的磷酸氢二钠或者硫酸铜。

eyeball：霉菌污染了用双抗的pbs冲洗基本是没什么作用，只能是浪费。关键是液体一定要保持无菌。培养液过滤后要取一点先放培养箱预培养三天，无菌生长后再用。

dongshiwu：我曾经就回来过遭霉菌污染了的细胞。如果细胞好养或有存货的话，干脆从头作起，要是舍不得可以用PBS液洗3遍，在新的培基中加两性霉素。

XTYang：最好弃掉，要不在以后的培养基中加Invitrogen公司的Fungizone，多换几次后也可。

wangfx_vet：我最近养的细胞总是出现空泡并且不断死光。改变血清浓度也没有用，不知道怎样解决

俺来了：是不是排出污染，比如霉菌包子感染可能这样，因为我的前面一批细胞就这样，培养基不混，细胞内有很多空泡，且可见一些比细胞大得多无明显细胞结构的“圆形细胞”里面有很多小的空泡，如果是这样的话，那就是霉菌污染，但愿你的不是，否则，什么都得重来！

wangfx_vet：对对！就是楼上老师说得那样！那末说我的细胞是污染霉菌了！！！？？？那我就惨了，这是引进的细胞哎，没了就永远没了！没有拯救的办法吗？

hkai97：霉菌污染是很烦的问题,试试杀霉菌的药物.这只能是死马当活马医了.重要的是预防.常做清洁和消毒,保持实验室的洁净度.否则还会出现细胞污染.

doctormeng：谁知道细胞培养血清中出现黑焦虫，该怎么办？ 有没有专门对付他的东东，比如抗生素之类？我养的细胞中出现了：中间一个黑黑的东西，其四周包围有象棉花样的的东西，不知是不是黑浆虫。其周围的东东，有点类似于菌落。 

huiql：我以前也遇到过这种情况，估计可能是真菌污染，慢慢地培养液就变混了，有人说用制霉菌素在刚出现时可以制服，但我没有试过，听说南方的真菌污染和北方的不一样，这种可能属于南方的。

义超：先需确定到底是何种微生物，可以去微生物科做细菌培养来确定。如果是真菌，细胞又实在很难得，可在细胞培养液中加入二性霉素D来挽救，也许有用。

hantian：黑胶虫好象不是诸位描述的样子。我碰到的黑胶虫有点类似与杆状细菌，但长度比细菌长，而且会左右摆动，甚至游动。这是血清中带来的，不属于细菌，普通的抑菌方法是没用的，而且他长势很快，所以遇到这种情况只能倒掉。也有人说，进口血清中的黑胶虫要甚与国产血清。

ph123：同意楼上的意见。我亦在细胞培养中遇到同样的问题,胶虫成熟后呈线状,可以快速移动,一般由血清中带来,如果发作的话只有把细胞弃掉,而且要赶快换血清。但你描述的情况还不能肯定是胶虫,可以通过培养,在油镜下观察一下,看是否是污染. 另外如果你观察到的情况没有发展,细胞不受影响的话,亦可能是血清中的纤维蛋白沉淀.

icesugar75：As far as I know, the black cluster is mostly 霉菌, since I encountered it before. But you could know it quickly if it is 霉菌, becaue 霉菌 is growing very fast, finally showing up in unclear appereance

csdoctor：听协和基础所的陈实平老师说，她并不认为真有什么黑焦虫。

icesugar75：一般霉菌很难控制，一天或是两天就长起来了。如果刚刚怀疑有霉菌，加双抗可能会好使，但说实话，刚刚开始要想判断是不是霉菌真是太难了，当时的霉菌类似死细胞，两三个小团在一起，暗的，如果不是特别有经验，很难说是不是。所以如果发现有小黑点，取出一点放入37度培养箱中一天就知了，而把余下的血清冻好。如果运气好，双抗会管用，不好就扔了吧。

lim99011：双抗好像对霉菌没有用吧?我好像记得霉菌用的是两性霉素,双抗没有作用的.

zzy8896：一点经验之谈！我在养pc12细胞时出现过这种情况，我的细胞也是莫名奇妙的出现，而且过几天后，细胞活力状态明显下降，最后死亡，但不同于一般的细菌和霉菌。我请教了许多人，没有结果。我试用g418加在培养基中，养了一阵子，后来就消失了，但你要摸一下浓度。到现在我还是没有搞清楚什么原因，可以试一下。我倾向于它是一种特殊的细菌

ronic：我也觉得双抗对霉菌没有用，加抗真菌的药试试看了，不过好像很贵，而且细胞对它的耐受性比较差。

Yong：建议慎用G418，除非你的细胞有抗性

happywind：养原代，不幸4天后发现多瓶惨遭霉菌毒手，有一瓶细胞贴壁挺好，且菌丝没有沾在瓶底上，因此我想试着救救这瓶细胞，换液，反复冲洗，最后再放进孵箱，结果过了两天，培养瓶里的细胞竟然长的挺好，没有丝毫霉菌污染的迹象。难道这样也可以！

kaize：不知污染的细胞的一些基本特性会不会改变

chelonian：但是这样的细胞，做实验结果可信吗

Skyhawk：这是我们实验室细胞培养出现的不像霉菌，不像死细胞的东西，培养越久越多，看看大家是不是也遇见过，是什么呢？什么原因引起的？

（图：http://cell.dxy.cn/bbs/topic/1650849）

以上图片取自转染有目的基因的cos7细胞，是在用G418筛选时出现的东西，不同细胞都有（vero细胞也是），我的师兄和师姐都出现有类似的情况，但我的细胞没问题（和师姐的实验目的一样，只是我是自己另外准备培养基的），目前他们都挺困惑的，希望得到dxyer的帮助！？

taolt：我感到是真菌污染，肯定不是培养液解冻后出现的东西。我们这里配好的培养液都先冻到－20度，等用的时候再拿出来用，已经有4－5年了，从来没有见过这样的东西。我有一次也是感染了真菌，与你的照片很相似，而且在早期并不影响细胞的生长，甚至细胞长得速度更快了。这可能是因为有的真菌会分泌一些能促进细胞生长的因子有关。加些抗真菌药物，要是不重要的细胞就扔掉吧。再看看细胞孵箱里有没有真菌斑！

Skyhawk：我们一般都是把培养液配成1X，过滤后放4度保存使用。所以，应该可以排除是培养液冻溶的问题。培养久了，细胞生长状态不好了，但培养液没有变浑，不像是细菌污染。真菌污染倒很有可能。谁有类似情况的照片放上来看看？

曾经用不含抗生素的培养基出现过细菌污染，反复用双倍抗生素的PBS洗后，用含抗生素的生长液培养，不再出现污染。看来这个方法可以用于一般的细菌污染的解救。

如果是真菌污染，我想可以用类似的方法，但抗生素要用相应的抗真菌的。勤换液。但这个方法适合在污染不是很严重的时候用。

编辑: cq

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