细胞培养中霉菌污染问题

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发布日期：2012-02-20 12:56 文章来源：丁香通
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关键词： 丁香园 生物专题 义翘神州 细胞培养 细胞污染 　 点击次数：

helenm：培养的细胞有轻度的霉菌污染，有办法补救么？ 这可是我辛苦养了两个月的细胞。

iris_cql：以我以前养各类细胞的经验，出现霉菌的最好补救方法：

1、重新配置所用的全部培养液、PBS、消化液等，确保无菌！

2、用双蒸水洗细胞1－2次，然后在用PBS洗细胞1－2次。记住动作一定要轻柔！后换上新配的培养液！

3、彻底打扫细胞室，培养箱等。

little_G：偶的经验是，如果发生霉菌污染，最好是马上检测，一般轻微霉菌污染对检测结果的影响不大。至于想解救，你想想用什么抗菌素能行呢，除非你用复康唑，那也难说好用。最好彻底重来，只要不影响别人的和自己的其他细胞就算万幸了。

小样－菜鸟跑路：霉菌污染是不是培养基一定变混浊？霉菌能进入细胞吗？在我印象中是培养基变得很混，能见到白色的菌丝之类的，细胞状态不是很好。可是有人说霉菌污染能进入细胞，是真的吗？

loyal1006：霉菌污染后培养基不一定会变混，是否变混要看霉菌的生长速度。霉菌污染肯定会影响细胞生长，最终结果是导致细胞脱落、死亡。霉菌较大，污染后很容易在显微镜下看到大量的典型的霉菌丝。

angel2004：我的细胞被真菌污染了，有什么补救措施

sonina你用两性霉素处理，最好作抑菌试验，确定使用浓度。之后，用两性霉素的培养液培养一代，如果霉菌消失，换用正常的培养液（即没有两性霉素的培养液）培养一代，如此反复3次，确定没有霉菌后，以致可用正常培养液培养。这样太浪费时间，最好还是弃掉污染的细胞，重新复苏新细胞。

zhanghong38：我是一个试验新手，现培养血管内皮细胞，反复遇到霉菌污染问题，已试过用酒精和新洁尔灭试擦孵箱，但均不奏效，恳请各位师兄师姐不吝赐教，感谢。

topgun：关于污染的问题，这涉及几个方面的因素：操作，超净台、孵箱。

（1）操作：做实验时应养成无菌观念（操作前用70%酒精檫手，实验时如吸管等物品接触到台面应立即更换，并隔3-5分钟用酒精灯烧灼吸管）。

（2）超净台：如果超净台使用时间过长（3-5年以上），应及时更换滤板。消毒的紫外灯管也按时更换。在操作前用酒精或新洁尔灭檫拭台面。

（3）孵箱：怀疑孵箱污染时，将孵箱关掉，然后用上述消毒剂消毒，之后用移动紫外消毒车将紫外灯插入孵箱照射30分钟以上。

zrzhong6519：还有注意孵箱内的水盆， 经常检查， 如发现有絮状物，立即更换灭菌水， 之前用75%乙醇擦拭， 第二天要及时察看是否彻底，不彻底在按上述方法再来。

lwangfang：我建议你们把所有的与培养相关的物品进行一次彻底的消毒，然后启动孵箱的自动消毒功能让其消毒过夜，再注意一下操作。我觉得物品污染的可能性比较大。

yoyo781206：反复遇到霉菌污染问题，最可能的还是在操作中不太注意无菌观念所致。应当要常用75%酒精消毒手，靠近火焰旁操作，注意吸管口，瓶口等不要接触到桌面或手等地方，如果碰到，尽可能弃用吸管，或者在火焰上烤一下。超净台也是关键的，每天使用前消毒30分钟，用完也应当消毒30分钟。孵箱，已试过用酒精和新洁尔灭试擦，应该可以视做是安全的。个人观点

ahui：主要考虑手的污染。

狮心：霉菌反复出现，还有一个问题要注意：环境湿度，必须注意除湿，长期不用的东西，使用前必须从新消毒，把冲洗消毒和培养分开

liuxiaohua889：以前是否养细菌?可以全面消毒再作,有条件换培养箱,无水的较好

miffyqx：感觉有细胞污染了，于是很不放心，请问染菌的培养瓶再污染别的瓶里细胞，直至污染整个培养箱里东西的几率有多大？以前听说过会这样的

香山雪林：你的培养箱采用什么样的抑菌方法？我现在采用的是：水盘中装饱和的硫酸铜溶液（无菌水配），有资料说可以增大保险系数。

miffyqx：我们的做法和你们差不多：饱和硫酸铜溶液配制后，高压蒸气灭菌，放在水盘里。这样很有用是吗？特别防箱内染菌？？

shyaroom：霉菌污染会染坏一箱子细胞，因为霉菌会飘，但细菌不会的。

yuefeiyf：硫酸铜只是保证水不长菌，对其他地方无效。

路遥只要抢救措施及时应该不会有大问题，我的细胞出现过霉菌污染，但及时用苯酚消了孵箱，用甲醛重熏了培养间，没出什么大问题．

pipi： CO2孵箱被霉菌污染后，可把所有细胞暂时转移，采用过氧乙酸擦洗孵箱（包括隔板，箱壁）。并把过氧乙酸放置在孵箱内一个小时，使其蒸汽弥漫。待过氧乙酸的气味消散后，再移入细胞。孵箱应定期清洁（2月左右），尤其在多雨的季节。

gongqiang：孵箱霉菌污染，经新洁尔灭及酒精彻底擦洗数次并紫外照射灭菌处理，仍有霉菌滋生，恳求高手出招解救！

203040：天气炎热，霉菌也开始肆无忌惮的繁殖。想想去年这个时候，也被霉菌折腾得郁闷无比。还好后来控制住了。经验如下：

1、细胞培养室大扫除，水池、吸引器中的引流瓶等无一不是霉菌孳生的地方。然后室内进行紫外灯照射杀菌。

2、培养箱消毒时是否注意了里面的几层钢板。紫外线照射时得拿出来。我当时干脆就放到180度烤箱里考过夜。

3、处理培养箱时还有个要考虑的地方，培养箱内的细胞培养瓶。重新放回去的时候得用酒精将瓶周搽洗数次，能换掉更好。

4、培养箱搽洗时重点在箱底的四个角落。

碰到顽固的霉菌孳生时的确很伤脑筋，最夸张的时候消毒第二天箱底就看到白色的点装物。总的原则就是彻底的杀、杀、杀！当时我就是这么处理的，后来情况大为改观。你可以再试试。

gongqiang：谢谢！我已经和霉菌奋战近一个月，我总是失败者！上述方法：如将培养箱能拆下的都经高温高压消毒，各个角落每天新洁尔灭、酒精擦洗，都不行，辛苦不敢说，努力总没结果！

amwwxf757：你应分析一下每次成功和失败的原因，用本子记下来。操作要细心。请一位有外科经验的人给你看一下是不是有漏的地方没有消毒好。全面包括各种试验品和培养器。

flyingpumc：因为霉菌有孢子的存在，所以酒精，新洁而灭，紫外线等等根本不可能去除霉菌！我们原来用过国外带回来的一种试剂稀释后可以用来抑制霉菌，但是我们没有发生过霉菌污染，所以不知道效果到底怎么样？而且这种试剂可以稀释后直接放在孵箱内，此试剂对细胞没有毒性！具体是什么我也忘了！！你自己好好查查吧！应该会有这种试剂卖！

zjuaxiu：有带消毒程序的培养箱，很方便。

jzyxynwm：整个培养间用福尔马林和高锰酸钾熏蒸,孵箱内部包括托盘等全部用苯酚搽洗,封闭2天,基本就没问题!!但培养良好的无菌观念是前提！真菌多数是空气中悬浮污染，所以除紫外线照射外，每次进出培养间要用来苏或者新洁尔灭搽地，减少空气悬浮颗粒及细菌！！

开心的水：一周清洗一次，75％酒精擦洗，再将温度打到94度持续3到4分钟。

wangyibo：孵箱内托盘的水中加一些硫酸铜可抑制霉菌。

无影剑客：做原代培养，20多天后已经传代或要传代时几瓶细胞均出现局部黏附在在瓶底的葡萄状漂浮物,摇晃后会有部分脱落。有两瓶突然出现浑浊，镜下找不到细菌。换液后漂浮物较前增多。疑为霉菌污染。原代培养做的好辛苦，突然发现大面积污染，最近一两个月的工作就要化为乌有。请教已经出现的污染有没有办法弥补。两性霉素B如何配制、贮存及污染后的最大应用剂量。

youngtiger：做原代培养出现污染原则上应遗弃细胞，但鉴于你的个人原因及我以往排除污染的经验，现给出以下建议：两性霉素，浓度范围1-50ug/ml，常用浓度3ug/ml；制霉菌素，浓度范围1-500U/ml，常用浓度50U/ml。两者任选其一。

Pathway：建议楼主楼主试一试用96孔(或48孔)细胞培养板来培养;这样局部的、偶然的污染不会使实验全军覆没。因为我也经常要做原代培养，一般会同时接种细胞培养皿和96孔板。因而有时会出现这样的情况：5块96孔板总共只有4、5个孔污染了，但所有的细胞培养皿都污染了。从来没有发现细胞培养皿没有污染，但96孔培养板却污染了（至少目前是这样）。对有污染的培养孔，我一般用8M的NaOH处理（加热至70－80度，污染也从来就没有扩大过）。总之，原代培养出现的污染多是机会性、偶然的，使用96孔或48孔细胞培养板是一种很好的控制污染的手段。（说到底是一种机械的、行之有效的隔离措施）

loyal1006：已出现污染一般是无法挽救的，两性霉素、制霉菌素也只能是预防污染，或许在污染的早期还有一点作用。目前关键是要找到污染源，以防下次再污染。

qingshi：这段时间大量养细胞，呵呵，880多个，那个多呀，可是竟然出现霉菌和酵母污染，于是，消毒处理，可是，污染照旧，于是大胆决定，撤掉水盘，呵呵，果然效果良好，已经20多天了，一切正常，顺便说一下，我同时养的悬浮、贴壁。加入10ml培养液，3天换液，没问题。

Pathway：楼主不是同时养880种细胞吧？而是用了96孔培养板养了多种细胞吧？我觉得国内还没有那个单位和公司能同时养880种不同的细胞。另外，不要水盘的话，楼主怎么保证培养箱内的相对湿度呢？（培养箱内的高湿度和温暖的环境确实是最适合霉菌生长的），我的培养箱内也可见长有很多的霉菌，但会引起细胞培养瓶内的细胞污染的可能性却很小（即使使用细胞培养皿和细菌培养皿也是如此）；不过，由于我的培养箱可自动消毒，我一般每个季度都会消毒一次。

qingshi：no。贴壁细胞无法用96孔板，当然不会一次性培养880种，而是持续培养，一般维持在80多个，使用50ml的培养瓶。我也担心湿度问题，但是没什么大问题。

小毒物：我正在养细胞,一开始有10瓶,不断的养,不断的有真菌污染,现在剩下4瓶了.因为也并不是所有细胞都出现污染,大家帮忙分析一下应该注意哪些问题?

juju：真菌污染是细胞培养过程中常见的问题。首先，环境需要清洁，超做台每天用新洁尔灭清洗是必要的。然后在培养基中适量添加制霉菌素，和两性霉素可以抑制真菌及其他霉菌的生长。再者，超做时加以注意。应该对你有帮助的。细胞培养过程中常见的问题建议你可以看看“细胞培养实验指南”一书。里面有更详细的讲解。

mlfyandw2002：最好的方法就是丢掉它,然后用甲醛熏蒸,再就是集体放假一个星期.再回来重新做过.

小毒物：谢谢两位,我已经将孵箱用甲醛熏过一次了,每次照台子之前用酒精擦台子,紫外线照30分钟,操作也很注意,但还是不能幸免遇难,看来要加制霉菌素等试试看了

编辑: cq

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